第六章空间排阻色谱法第七章第一节一、定义空间排阻色谱法又名尺寸排阻色谱法（SEC）也叫凝胶色谱法，是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。它是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作便捷、不需要有机溶剂、对高分子物质有很高的分离效果，被大范围的应用于大分子分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。空间排阻色谱法固定相为化学惰性多孔物质——凝胶。二、基础原理分子筛效应：凝胶色谱的原理为分子筛效应，即凝胶具有区分分子大小不同的物质的能力。在凝胶色谱中，作为固定相的凝胶是一种不带电荷的具有三维空间网状结构的基质，每个颗粒的细微结构如同一个筛子，所有筛孔的直径是一致的。凝胶的这种结构使得小分子可在筛孔中自由地扩散、渗透，而大分子则被排阻于颗粒之外，如此起到筛分大小分子的作用。当含有大小分子的混合物样品加入到层析柱中后，这些物质随洗脱液的流动而向前移动；相对分子质量大小不同的物质受阻滞的程度不同。相对分子质量大的物质沿凝胶颗粒间的孔隙随洗脱液移动，流程短，移动速度快，先流出层析柱；相对分子质量小的物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，后流出层析柱。样品中分子大小不同的物质如此逐渐分离。其分离过程如下：1、混合物上柱；2、洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，分子则被排阻于凝胶颗粒之外；3、小分子被滞留，大分子向下移动，大小分子开始分开；4、大小分子完全分开；5、大分子行程较短，已洗出层析柱，小分子尚在行进中。三、特点：1、设备简单、操作便捷、周期短、样品回收率高；2、层析后，无需对凝胶进行再生处理，减少了工作量；3、凝胶是一种不带电荷的惰性载体，与溶质不发生化学反应，分离效果好，重复性高；4、洗脱条件温和，一般都会采用低离子强度（0.01mol/L）的洗脱剂，有些情况下还可以用水，所以不易使有效成分失活变性。凝胶色谱的缺点：1、分辨率不高，分离操作较慢2、分离时必须严控流速样品黏度不宜过高4、存在非特异性吸附现象应用：1、分子的组别分离、分级分离及制备；2、测定生物大分子的相对分子质量；3、高效率样品脱盐，一次脱盐达95％以上；4、去除热源物质；5、吸水，分批法浓缩样品；6、更换样品缓冲液。第二节凝胶色谱的重要参数一、分配系数是衡量溶质被排阻程度的特征常数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒网孔的直径有关，而与柱的物理参数无关。是特殊的情况，说明凝胶对组分产生了非特异性吸附。二、柱床体积（Vt凝胶层析柱的柱床体积（Vt）可分为三个部分：VtVi+VgVo称为外水体积，为凝胶颗粒间隙之间液体的体积；Vi称为内水体积，为凝胶颗粒内所含液体的体积；Vg为凝胶本身骨架的体积。由于Vg相对很小，可忽略不计，则有：VtVi三、洗脱体积（Ve）洗脱体积（Ve）一般介于VoVt之间（VtVi之间的关系可以表示为：VeVi（VtVi）完全排阻时：VeVo完全渗透时：VeVtVeVt时：分子与凝胶有吸附作用。四、排阻极限-有效分离的最大分子排阻极限代表能有效分离的最大分子量。即不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。例如：SephadexG-50的排阻极限为30,000，它表示分子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。五、分级分离范围分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶能够获得较好的线性分离。例如：SephadexG-75对球形蛋白的分级分离范围为3,000－70,000，它表示分子量在这个范围内的球形蛋白能够最终靠SephadexG-75得到较好的分离。六、吸水率和床体积吸水率：是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。床体积：是指1g干的凝胶吸水后的最终体积。第三节一类是以水为洗脱液的，用于生物大分子分离纯化的凝胶，如：天然琼脂糖凝胶、人工合成的聚丙烯酰胺凝胶等；另一类为以有机溶剂为洗脱剂的凝胶，如：交联聚苯乙烯、氧化锌交联的氯丁橡胶等，大多数都用在分离分析生物小分子、有机多聚物。二、凝胶的性质及类型1、性质三维空间的网状高聚物，有一定的孔径和交联度；不溶于水，但在水中有较大的膨胀度；拥有非常良好的分子筛功能；分离范围大：相对分子质量102、类型（1）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）由葡聚糖和3-氯-1.2-环氧丙烷（交联剂）以醚键相互交联而成的三维网状高分子聚合不相同的型号的葡聚糖凝胶由于交联度不同，使得筛孔大小、分级范围、吸水值、床体积都不同。葡聚糖凝胶型号用G表示，各种各样不同型号是以其吸水量的10干胶所吸收的水的质量。如，SephadexG–25表示该凝胶的吸水量为每g在SephadexG–25及G–50中分别引入羟丙基，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶，适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质，如胆固醇。交联葡聚糖凝胶在水、盐、碱、弱酸和有机溶剂中较稳定，在强酸或氧化剂中，则易使苷键水解断裂。中性条件下，120消毒10分钟而不变性。由于含羧基基团，故能与碱性蛋白质作用。因为胶中含OH基团，所以洗脱时用NaCl缓冲液。可用于分离蛋白质、核酸、酶、多糖、多肽、抗菌素、脱盐及测定蛋白质的相对分子质量等。（2）交联丙烯基葡聚糖凝胶（Sephacryl）其优点是它的分离范围很大，排阻极限还可以达到10，远大于Sephadex的范围。化学和机械稳定性很高，pH稳定范围为2-11，在5.5-8之间时，非特异性吸附作用最聚丙烯酰胺凝胶是全合成的凝胶，常用型号从P-2～P-300后的数字相当于排阻限度乘以10-3之值。Bio-Gel聚丙烯酰胺凝胶的稳定性不如交联葡聚糖凝胶，在酸性条件下，其酚胺键易水解为羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团，一般在pH4-9范围内使用。实践证明，聚丙烯酰胺凝胶层析对蛋白质相对分子质量的测定、核苷及核苷酸的分离纯化，均能获得理想的结果。4）琼脂糖凝胶琼脂糖是从天然琼脂中分离制备的链状多糖，琼脂糖链间以氢键相互连接形成琼脂糖束，经凝聚处理后构成琼脂糖凝胶。琼脂糖的商品名称有Sepharose（瑞典）、Bio-gelA（美国）、Segavac（英国）、Gelarose（丹麦）等多种，因生产厂家不同名称各异。Sepharose拥有非常良好的惰性，不带电荷，对盐酸胍及尿素等变性剂有较强的抵抗力，但对温度不稳定。在50保温一段时间，会逐渐融化，冰冻又会造成凝胶珠结构的不可逆破碎。因此Sepharose的使用温度在0-40。不适宜于干燥后再膨胀，使用时应避免剧烈搅动。Sepharose只能在pH4.5-9.0范围内使用；干燥状态下保存易破裂，故一般均存放在含防腐剂的水溶液中。1，3-二溴异丙醇在强碱条件下反应，即生成CL型交联琼脂糖，其耐热性和化学稳定性均有所提高，可在广泛pH溶液（pH3-14）中使用。三、操作方法1、凝胶的选择和处理 商品凝胶的型号很多，各种各样不同型号代表不同的筛分范围。在实际在做的工作中，主要是依据样品的性质和种类选择正真适合的凝胶。 分级分离，是对相对分子质量彼此相近的多组分物质的样品进行分离。选用排阻限度略大于样品中最高相对分子质量的凝胶，以使这些物质都能不同程度地渗入凝胶内部， 通过不同的洗脱流程，达到分离的目的。 市售凝胶商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。干凝胶缓慢地倾倒入5～10 去离子水中，参照有关的资料中凝胶溶胀所需时间（1-n天），进行充分浸泡，然后用倾 倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。 溶胀的目的是使凝胶充分膨化，若溶胀不充分，凝胶将在柱中继续膨化而影响到层析柱的均一性，严重时，会导致柱破裂。 沸水浴溶胀时间可缩短到1-2h，加热法不仅加速了溶胀过程，而且能杀灭凝胶中的微 生物，防止污染霉变。 2、凝胶柱的选择及装填 对于同样直径的层析柱，长柱的理论塔板数多，故比短柱分辨率比较高；而直径大的管壁效应低，又比直径小的分辨率比较高。 因此，理想的层析柱的直径与长度之比一般为1:25-1:100。 用作组别分离、制备时，样品量较大，采用短粗柱较为方便，常用20～30cm高的层析 柱，柱直径可尽量大以增加柱的容量； 分级分离时，采用细长柱，柱长度一般在100cm 左右，直径可在1～3cm 之间。 硬胶柱的装柱操作较容易，床体也易均一；在装软胶柱时，最关键的是要防止柱底部被压紧。 解决办法是：在柱的出口处接上一根硅胶管并向上延伸，以缓解柱底部的静水压力。另外，软胶更易滞留空气，必须在装柱前充分抽气。 凝胶沉积后，稍放置一段时间后再开始流动平衡，正常的情况下，硬胶放置 5min 胶放置15min 2-3倍床体积的平衡溶液流过后，可达到稳定状态。 检验新装好的柱的均一性，初步方法是根据经验用肉眼观察柱床是否均匀，有无纹路和气泡。 进一步的检查可用带色的高分子物质，如：兰葡聚糖–2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为 2g/L 的溶液过柱，观察色带的移动。如色带狭窄，说明柱床性 能良好；如色带出现歪曲，散乱扩散，则必须重新装柱。 因为凝胶层析的分配系数与样品的浓度无关，所以，理论上可使用较高浓度的样品。但在实验中，要得到好的分离效果，加样量必须适当。 一般来说，加样量越少或加样体积越小（样品浓度高），分辨率越高。通常组别分离，样品加样体积约为凝胶柱床体积的 10％～25 ％左右；分级分离，加样体积为柱床体积
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