Kd 是衡量溶质被排阻程度的特征常数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒网孔 的直径有关，而与 柱的物理参数无关。 Kd 的范围是：0 ≤ Kd ≤ 1 当 Kd = 0 时，即胶内浓度为 0，分子完全不能进入凝胶内部，处于全排阻状态； 当 Kd = 1 时，胶内浓度与胶外相等，即分子完全渗入凝胶网孔内部； 当 0 Kd 1 时，表示只有一部分凝胶的内体积可被组分利用。 Kd 1 是特殊的情况，说明凝胶对组分产生了非特异性吸附。
于以有机溶剂为流 动相，分离脂溶性物质，如胆固醇。 交联葡聚糖凝胶在水、盐、碱、弱酸和有机溶剂中较稳定，在强酸或氧化剂中，则易
使苷键水解断裂。中性条件下， 120℃消毒 10 分钟而不变性。由于含羧基基团，故能 与碱性蛋白质作用。因为胶中含 OH 基团，所以洗脱时用 NaCl 缓冲液。可用于分离蛋 白质、核酸、酶、 多糖、多肽、抗菌素、脱盐及测定蛋 白质的相对分子质量等。 （ 2）交联丙烯 基葡聚糖凝胶（ Sephacryl） 交联丙烯基葡聚糖凝胶是由丙烯基葡聚糖经次甲基双丙烯酰胺交联而成的一种凝胶。 其优点是它的分离范围很大，排阻极限还可以达到 108，远大于 Sephadex 的范围。 化学和机械稳定性很高，pH 稳定范围为 2-11，在 5.5-8 之间时，非特异性吸附作用最 小。 （3）聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P） 聚丙烯酰胺凝胶是全合成的凝胶，常用型号从 P-2～P-300 共 10 种，P 后的数字相当于 排阻限度乘以 10-3 之值。Bio-Gel P 的市售形式为颗粒状干粉，在水溶剂中自动吸水溶 胀。 聚丙烯酰胺凝胶的稳定性不如交联葡聚糖凝胶，在酸性条件下，其酚胺键易水解为羧 基，使凝胶带有一定的离子交换基团，一般在 pH4-9 范围内使用。 实践证明，聚丙烯酰胺凝胶层析对蛋白质相对分子质量的测定、核苷及核苷酸的分离 纯化，均能获得理 想的结果。 4）琼脂糖凝胶 琼脂糖是从天然琼脂中分离制备的链状多糖，琼脂糖链间以氢键相互连接形成琼脂糖 束，经凝聚处理后 构成琼脂糖凝胶。 琼脂糖的商品名称有 Sepharose（瑞典）、Bio-gel A（美国）、Segavac（英国）、Gelarose
样品中分子 大小不同的物质如此逐渐分离。 其分离过程如下： 1、混合物上柱； 2、洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内， 大 分子则被排阻于凝 胶颗粒之外；3、小分子被滞留，大 分子向下移动，大小分子 开 始 分 开 ； 4、大小分子完全分开； 5、大分子行程较短，已洗出层析柱，小分子尚在行进中。 三、特点： 1、设备简单、操作便捷、周期短、样品回收率高；2、层析后，无需对 凝胶进行再生处理， 减少了工作量； 3、凝胶是一种不带电荷的惰性载体，与溶质不发生化学反应，分离效果 好，重复性高；4 、洗脱条件温和，一般都会采用低离子强 度（0.01mol/L）的洗脱剂， 有些情 况下还可以用水 ，所以不易使有效成分失活变性。
物质配制成质量浓度为 2g/L 的溶液过柱，观察色带的移动。如色带狭窄，说明柱床性 能良好；如色带出 现歪曲，散乱扩散，则必须重新装柱 。 3、加样 因为凝胶层析的分配系数与样品的浓度无关，所以，理论上可使用较高浓度的样品。 但在实验中，要得 到好的分离效果，加样量必须适当。 一般来说，加样量越少或加样体积越小（样品浓度高），分辨率越高。通常组别分离， 样品加样体积约为凝胶柱床体积的 10％～25 ％左右；分级分离，加样体积为柱床体积 的 1％～5 %。 加样方法：同离子交换柱层析一样，凝胶床经平衡后，吸去上层液体，待平衡液下降 至床 表面时， 关闭流出口 ，用滴管 加入样品液 ，打开流 出口，使样 品液缓慢渗 入凝胶 床内。当样品液面恰与凝胶床表面持平时，小心加入数 mL 洗脱液冲洗管壁。然后继续 用大量洗脱液洗脱 。 4、洗脱 凝胶层析所用洗脱剂，应使样品具有最大的稳定性。 正常的情况下，洗脱液与平衡凝胶所用的液体相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发 生变化而影响分离 效果。 洗脱液可以为酸、碱、盐溶液或者缓冲液，这些溶液除了可增加样品的溶解度外，还 能抑 制凝胶的 非特异性吸 附作用， 使洗脱峰不 拖尾。但 要注意避开 使用硼酸盐 溶液， 因为在碱性条件下 硼酸能与作为凝胶介质的多糖形成络 合物。 在分离不带电荷的中性物质的时候，由于无离子交换的吸附现象存在，用蒸馏水即可。 洗脱与凝胶吸附强的物质时，可在水溶液中加入一定量的有机溶剂，如甲醇、乙醇等。 对于非水溶性物质的洗脱，可采用苯、丙酮等有机溶剂。 凝胶与离子交换树脂不同，当加压超过一定限度时，凝胶会被压紧，不仅不能提高流 速，反而会使流速 严重下降。 洗脱时用于流速控制的装置最好的是恒流泵。能控制流速稳定，在较大范围内使用。 但当 层析时间 较长时，会 造成柱床 逐渐压紧， 柱出口流 量降低，凝 胶从柱底挤 出或层 析装置损坏等后果 。 网孔直径不同的凝胶基质所能承受的流速是不同的。通常硬胶柱的流速与柱的压力差 成正 比，与柱 长成反比， 与柱直径 无关，而软 胶柱的流 速还与柱直 径有关，并 且只有 在合适的流速下才 能达到理想的分离效果。 一般来说，硬胶的平均流速为 8-12ml/ cm2.h 为宜，而软胶的相应流量为 2-5ml/cm2.h 为宜。 5、柱的重新装 填与再生 由于凝胶层析的原理是分子筛效应，正常的情况下，载体不会与被分离的物质发生任何 作用 ，而且洗 脱液可将所 有组分都 洗下，因此 一次装柱 后，只要重 新平衡，即 可反复 使用 。但使用 多次后，由 于床体积 变小，流动 速率降低 或杂质污染 等原因，使 分离效 果受一定的影响。 此时，需将柱中凝胶倒出，重新装柱。也可用反冲的方法，在柱底部出口接上恒流泵， 通入 液体，使 凝胶松动， 再行沉降 。有时柱顶 杂质集聚 也会使流速 降低，将表 面凝胶 层除去即可。 凝胶的再生处理解决措施是用 0.5mol/LNaOH （含 0.5 mol /LNaCl）混合液浸泡。当污染很 严重时，可用 0.5mol/L 的 HCl 溶液作短时间处理。 6、防霉和保存 葡聚糖凝胶和琼脂搪凝胶都是多糖类物质，容易被微生物污染，微生物分泌的酶能水
空间排阻色谱 法又名尺寸排阻色谱法（SEC）也叫 凝胶色谱法，是按分子大小顺序进行 分离的一种色谱方 法。
它是六十年代 初发展起来的一种快速而又简单的分 离分析技术，由于设备简单 、操作方 便、不需要有机溶 剂、对高分子物质有很高的分离效果 ，被大范围的应用于大分子分级，即用 来分析大分子物质 相对分子质量的分布。
（丹麦）等多种， 因生产厂家不同名称各异。 Sepharose 拥有非常良好的惰性，不带电荷，对盐酸胍及尿素等变性剂有较强的抵抗力，但
对温度不稳定。在 50℃保温一段时间，会逐渐融化，冰冻又会造成凝胶珠结构的不可 逆破碎。因此 Sepharose 的使用温度在 0-40℃。不适宜于干燥后再膨胀，使用时应避免 剧烈搅动。 Sepharose 只能在 pH4.5-9.0 范围内使用；干燥状态下保存易破裂，故一般均存放在含 防腐剂的水溶液中 。 Sepharose 与 1，3-二溴异丙醇在强碱条件下反应，即生成 CL 型交联琼脂糖，其热稳定 性和化学稳定性均有所提高，可在广泛 pH 溶液（pH3-14）中使用。 三、操作方法 1、凝胶的选择 和处理 商品凝胶的型号很多，各种各样不同型号代表不同的筛分范围。在实际在做的工作中，主要是依据样品 的性质和种类选择 合适的凝胶。 利用凝胶分离混合物可大致分为组别分离和分级分离两种。 组别分离，即仅需将混合样品中的大分子和小分子分开，宜用高交联度的凝胶。 分级分离，是对相对分子质量彼此相近的多组分物质的样品进行分离。选用排阻限度 略大于样品中最高 相对分子质量的凝胶，以使这些物质都能不同程 度地渗入凝胶内部， 通过不同的洗脱流 程，达到分离的目的。 市售凝胶商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。干凝胶缓慢地倾倒入 5～10 倍的 去离子水中，参照有关的资料中凝胶溶胀所需时间（1-n 天），进行充分浸泡，然后用倾 倒法除去表面悬浮 的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液 中的气泡，准备装柱。 溶胀的目的是使凝胶充分膨化，若溶胀不充分，凝胶将在柱中继续膨化而影响到层析 柱的均一性，严重 时，会导致柱破裂。 沸水浴溶胀时间可缩短到 1-2h，加热法不仅加速了溶胀过程，而且能杀灭凝胶中的微 生物，防止污染霉 变。 2、凝胶柱的选 择及装填 对于同样直径的层析柱，长柱的理论塔板数多，故比短柱分辨率比较高；而直径大的管壁 效应低，又比直径 小的分辨率比较高。 因此，理想的层析柱的直径与长度之比一般为 1:25-1:100。 用作组别分离、制备时，样品量较大，采用短粗柱较为方便，常用 20～30cm 高的层析 柱，柱直径可尽量 大以增加柱的容量； 分级分离时，采用细长柱，柱长度一般在 100cm 左右，直径可在 1～3cm 之间。 但以上只是经验数据，在实际在做的工作中，要根据详细情况作相应调整。 凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。 硬胶柱的装柱操作较容易，床体也易均一；在装软胶柱时，最关键的是要防止柱底部 被压紧。 解决办法是：在柱的出口处接上一根硅胶管并向上延伸，以缓解柱底部的静水压力。 另外，软胶更易滞 留空气，必须在装柱前充分抽气。 凝胶沉积后，稍放置一段时间后再开始流动平衡， 正常的情况下，硬胶放置 5min ，软 胶放置 15min 。 柱床经 2-3 倍床体积的平衡溶液流过后，可达到稳定状态。 检验新装好的柱的均一性，初步方法是根据经验用肉眼观察柱床是否均匀，有无纹路 和气泡。 进一步的检查可用带色的高分子物质，如：兰葡聚糖–2000、细胞色素，或血红蛋白等
（Vt = Vo Vi） 完全排阻时：Ve = Vo 完全渗透时： Ve = Vt Ve Vt 时：分子与凝胶有吸附作用。 四、排阻极限-有效分离的最大分子 排阻极限代表能有效分离的最大分子量。即不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的 分子量。 例如：Sephadex G-50 的排阻极限为 30,000，它表示分子量大于 30,000 的分子都将直接 从凝胶颗粒之外被 洗脱出来。 五、分级分离范围 分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这 种凝胶能够获得较 好的线性分离。 例如：Sephadex G-75 对球形蛋白的分级分离范围为 3,000－70,000 ，它表示分子量在 这个范围内的球形蛋白能够最终靠 Sephadex G-75 得到较好的分离。 六、吸水率和床体 积 吸水率：是指 1g 干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水份。所
分子筛效应 ：凝胶色谱的原理为分子筛 效应，即凝胶具有区分分 子大小不同的物质的 能力。
在凝胶色谱 中，作为固定相的凝胶是一种不带电 荷的具有三维空间网状结 构 的 基 质 ， 每个颗粒的细微结 构如同一个筛子，所有筛孔的直径是 一致的。凝胶的这种结构使得小分 子可在筛孔中自由 地扩散、渗透，而大分子则被排阻于 颗粒之外，如此起到筛分大小分子 的作用。
以它不能表示凝胶 装柱后的体积。 床体积：是指 1g 干的凝胶吸水后的最终体积。 第三节 凝 胶 一、凝胶的分类 凝胶层析支持剂的品种可分为两大类： 一类是以水为洗脱液的，用于生物大分子分离纯化的凝胶，如：天然琼脂糖凝胶、人
工合成的聚丙烯酰 胺凝胶等； 另一类为以有机溶剂为洗脱剂的凝胶，如：交联聚苯乙烯、氧化锌交联的氯丁橡胶等，
主要用于分离分析 生物小分子、有机多聚物。 二、凝胶的性质及 类型 1、性质 三维空间的网状高聚物，有一定的孔径和交联度；不溶于水，但在水中有较大的膨胀
度；拥有非常良好的分子筛功能；分离范围大：相对分子质量 102～108。 2、类型 （ 1）交联葡聚 糖凝胶（Sephadex） 由葡聚糖和 3-氯-1.2-环氧丙烷（交联剂）以醚键相互交联而成的三维网状高分子聚合
凝胶色谱的缺点：1、分辨率不高，分离操作较慢 2、分离时必须严控流速 3、
应用： 1、分子的组别分离、分级分离及制备； 2、测定生物大分子的相对分子质量； 3、高效率样品脱盐，一次脱盐达 95％以上；4、去除热源物质； 5、吸水，分批法浓缩样品； 6、更换样品缓冲液。 第二节 凝胶色谱的重要参数 一、分配系数 分 配 系 数 Kd 为 样 品 组 分 在 内 水 体 积 和 在 外 水 体 积 中 的 浓 度 分 配 关 系 ：
当含有大小 分子的混合物样品加入到层柱中后，这些物质随洗 脱液的流动而向前移 动；相对分子质量大小不同的物质受阻滞的程度不同。
相对分子质 量大的物质沿凝胶颗粒间的孔隙随洗 脱液移动，流程短，移动速度快，先 流出层析柱；相对 分子质量小的物质可通过凝胶网孔进 入颗粒内部，然后再扩散出来，故 流程长，移动速度 慢，后流出层析柱。
物。 不同型号的葡聚糖凝胶由于交联度不同，使得筛孔大小、分级范围、吸水值、床体积
都不同。 葡聚糖凝胶型号用 G 表示，各种各样不同型号是以其吸水量的 10 倍命名的，即每 g 干胶所吸收
的水的质量。如，Sephadex G–25 表示该凝胶的吸水量为每 g 干胶能吸 2.5 克水。 在 SephadexG–25 及 G–50 中分别引入羟丙基，即可构成 LH 型烷基化葡聚糖凝胶，适用
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